A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简要
取材：迄今为止正蹂躏全世界的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和海地区大流行，截至 2021 年 4 年底已造成有约 1.28 亿人感染者，有约 280 500人死亡者。现阶段，已有可有效率降低 COVID-19 伤人率的用药方法有。我们研究岗位了一种习惯的之药用植物抗生素抗生素——厌肺毒抗生素液 (RDS) 的潜在炎冠状大肠杆菌能活普遍性，该抗生素液主要果糖为东方医学习惯之中用于用药胃部结核病的之中精油。
结果：RDS 选择普遍性 SARS-CoV 太快大肠杆菌、SARS-CoV-2 太快大肠杆菌、复合肝炎病毒大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 实为型大肠杆菌以及传染普遍性 SARS-CoV-2 和则有的 Ha-CoV-2 种属下大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶酶的感染者。我们有利于验证了 RDS 可以从外部灭能活 SARS-CoV-2 大肠杆菌薄膜的传染普遍性。此外，我们方知到 RDS 还可截断肝炎病毒霍乱大肠杆菌对靶酶的感染者。
论证：RDS 可普遍选择普遍性细菌感染大肠杆菌感染者。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，炎大肠杆菌用药，厌肺毒抗生素液，习惯之药用植物，SARS-CoV，肝炎病毒霍乱，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌
▋取材
迄今为止正蹂躏全世界的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和海地区大流行，截至 2021 年 4 年底已造成有约 1.28 亿人感染者，有约 280 500人死亡者。现阶段，已有可有效率降低 COVID-19 伤人率的用药方法有。新成现的 COVID-19 大肠杆菌微生物为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急普遍性颤动综合征关的冠状大肠杆菌种类之中的姊妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在之东亚方知到的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 年底在惠州市首次被方知到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年底在重庆首次被方知到[1,7,8]。在之东亚，这两次由冠状大肠杆菌造成了的疫情之中，之药用植物均被普遍应用于，来作紧急遏制冠状大肠杆菌造成了的结核病。对于现阶段的 COVID-19 大流行，之东亚有有约 85% 的 SARS-CoV-2 感染者患者遵从了习惯之护理学抗生素（9，10）。许多应用于的之药用植物是否不具有效率的炎冠状大肠杆菌特普遍性并在诊断上是否有效率，这个极为重要问题都已赢取充分答复。
之药用植物作为用药冠状大肠杆菌所引发结核病的有效率抗生素，但由于不够细胞内或排泄的系统研究岗位，其转变与合理应用于均受到了阻碍。为了确认之药用植物的潜在炎 SARS-CoV-2 能活普遍性，我们从都用之药用植物之中抽样了多种精油精油，并从之药用植物抗生素液 RDS(英国一种商业普遍性饮品补充剂) 之中方知到了炎 SARS-CoV 和炎 SARS-CoV-2 大肠杆菌的能活普遍性，一种在英国的商业饮品补充剂。RDS 用于弱化药剂颤动系统的总体健康，其包包涵多种精油果糖，如人参和酢浆草，它们是习惯上用于高度集中黏膜和胃部结核病的之中精油 (11-13)。在此，我们刊文 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 实为大肠杆菌以及不具感染者普遍性的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对靶酶的感染者不具选择普遍性关键作用。我们有利于验证 RDS 可通过从外部灭能活大肠杆菌薄膜或阻拦大肠杆菌侵入而选择普遍性大肠杆菌的20世纪感染者时程。此外，我们方知到 RDS 还可以阻拦七轮流大肠杆菌对靶酶的感染者。这些除此以外，RDS 对细菌感染大肠杆菌的感染者或许不具普遍的选择普遍性关键作用。
▋结果
为了从习惯之中精油之中找到潜在的炎 SARS-CoV-2 能活普遍性，我们从约四十种习惯精油之中抽样浓缩成 SARS-CoV-2S 酶实为型太快大肠杆菌[14,15] 和药剂胃部 A549(ACE2) 靶酶，此本能 ACE2 基因都会通过太快大肠杆菌转导作为多种形式介导，从而稳定转导来充分来进行微传达。太快实为型大肠杆菌应用于深蓝色荧光酶 (GFP) 或荧光伦酶 (Luc) 作为刊文基因，并通过了不具广谱炎大肠杆菌离开选择普遍性剂，以及阿比巴格 (Arbidol)[16]，和本能炎毒血清对炎 SARS-CoV-2(绘成 1a、C) 的验证。我们必须取得成功测到阿比巴格 (Arbidol) 和炎毒血清对于 SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌的选择普遍性关键作用，这是我们在其他四十余种习惯精油精油检验之中没有方知到的，仅限于其之中一些实为定极低毒普遍性的精油 (绘成 1a-C)。然而，鉴于太快普遍性实为型大肠杆菌大部分能测 SARS-CoV-2 大肠杆菌的侵入举动，我们没法剔除这些精油精油或许有在离开后阶段必须选择普遍性 SARS-CoV-2 的或许普遍性。我们有利于从习惯本品厌肺毒抗生素液 (RDS) 之中抽样成了或许的炎 SARS-CoV-2 能活普遍性，该产品包包涵则有精油果糖——、人参、人参、酢浆草、天名精、苦杏仁、蜂房、皂角、姜黄，在之东亚习惯上用于用药胃部结核病 (11-13)。
包包涵羧硫果汁硫、3，4-二邻果汁七轮酰钠盐硫、羧硫 3，4-二邻果汁七轮酰钠盐硫、原儿茶硫、羧硫绿原硫和木犀草伦；新叶之中还包包涵有机体碱 A、B 和 10 种已知环酰醚芳香烃有机体碱[17]；该豆科植物还包包涵皂甙甙 A 和 B，以及炎黏膜关键作用的有机体碱 C[18,19]。人参七轮基有机体碱之中包包涵木脂伦、松脂丙衍生物人参有机体碱[20]。人参之中包包涵被称为人参皂有机体碱的甾体皂有机体碱，是人参属下豆科植物独有的豆科植物化学物质[21,22]。红果酢浆草之中主要能活普遍性果糖为四种单芳香烃，(−)-香草衍生物、(+)-普莱格衍生物、(−)-柠檬酰和 (+)-香草呋喃；这种豆科植物还包包涵其他有机化合物，如 1-辛酰-3-醇、3-辛衍生物、β-年底桂酰和β-酢浆草酰[23]。天名精包包涵有约 162 种有机化合物，仅限于环酰醚芳香烃和环酰醚芳香烃有机体碱、苯丙有机体碱、有机硫、酚、果糖、黄衍生物类、和皂有机体碱[24]。苦杏仁之中包包涵苯七轮酸、氰基有机化合物和淀粉糖蛋白[25]。皂角刺之中包包涵皂有机体碱和羽扇豆硫[26,27]，而姜黄之中包包涵主要能活普遍性果糖姜黄硫[28]。为了有利于检验 RDS 的炎 SARS-CoV-2 能活普遍性，用多种不同乙醇分子量的 RDS 模板 A549(ACE2) 酶，然后让这些酶在实为定 RDS 的原因遵从 4-6 星期的感染者。感染者后，在不实为定 RDS 的原因培育出酶，然后在 48 和 72 星期的时候，通过流型式酶绝技对大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用完成二阶。为了高度集中酶毒普遍性，应用于高氯硫丙啶 (PI) 对再一死亡者和已死亡者的酶完成染，大部分在能活酶群之中二阶 GFP+酶。如绘成 2 下图，我们推论到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 实为大肠杆菌不具抗生素缺少普遍性选择普遍性关键作用。为了属下实这些结果，我们应用于内源普遍性传达 ACE2 的 VeroE6 酶多次重复了该感染者测试。
(方知下页绘成)
ACE2 结构上传达，产成普遍性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其完成感染者，ACE2 通都用于冠状大肠杆菌的研究岗位 (7)。考虑到在不够 ACE2 微传达 [15，29，30] 的原因，实为型大肠杆菌对 VeroE6 的感染者普遍性较低，我们还应用于了荧光伦酶刊文基因实为型大肠杆菌，该大肠杆菌的刊文基因传达由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，不具更高的刊文基因敏感普遍性和传输速率。
绘成 2：RDS 选择普遍性 SARS-CoV-2(GFP) 实为型大肠杆菌感染者 A549(ACE2) 酶。
A.A549(ACE2) 酶用 RDS 不间断乙醇 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 实为型大肠杆菌感染者。将酶沾去大肠杆菌和 RDS，并在不实为定 RDS 的原因完成培育出。流型式酶郭子测大肠杆菌感染者选择普遍性原因。未感染者的酶和感染者 SARS-CoV-2(GFP) 但予以 RDS 用药的酶作为对应。GFP+酶百分比已结果显示。(PI) 高氯硫丙啶。
B.RDS 的酶毒普遍性定量。A549(ACE2) 酶用 RDS 不间断乙醇 4 星期，沾去 RDS，无 RDS 培育出 48 星期。高氯硫丙啶染解剖刚刚死亡者酶和已死亡者酶，流型式酶绝技二阶。素描抗生素-化学反应酶毒普遍性直线，RDS 的半伤人分子量 (LC50) 数量为 1:11.9。
如绘成 3A 下图，我们应用于 Luc 报告基因实为大肠杆菌和 VeroE6 酶完成感染者测试，推论到 RDS 对该大肠杆菌感染者不具抗生素缺少普遍性选择普遍性关键作用，并且半数选择普遍性分子量确认为 1:230RDS 乙醇度 (绘成 3B)。我们还二阶了 RDS 对 VeroE6 酶能活力的影响，确认了 50% 酶死亡者抗生素为 1:11.8RDS 乙醇度。
绘成 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 实为大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的抗生素缺少普遍性选择普遍性选择普遍性关键作用。用 RDS 不间断乙醇模板 A、BVeroE6 酶，还用 SARS-CoV-2(Luc) 实为型大肠杆菌感染者。将酶沾去大肠杆菌和 RDS，并在不实为定 RDS 的原因完成培育出。在感染者后 72 星期用荧光伦酶测大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用。未感染者酶和 SARS-CoV-2-luc 感染者但予以过 RDS 用药的酶作为对应。测试多次重复三次。素描抗生素化学反应直线和 RDS 的 I-C50 乙醇数量为 1:230。CRDS 对 VeroE6 酶的酶毒普遍性也通过高氯硫丙啶染和流型式酶绝技定量。用 RDS 不间断乙醇 4 星期，沾去 RDS，在不包涵 RDS 的原因培育出 72 星期。素描酶毒普遍性抗生素-化学反应直线，RDS 的半伤人分子量 (LC50) 数量为 1:13.8 乙醇。DRDS 选择普遍性传染普遍性 SARS-CoV-2 感染者。用不间断乙醇的 RDS 模板 VeroE6 酶，并在 RDS 实为定的原因感染者 SARS-CoV-2。感染者 48 星期后，通过怪菌斑二阶大肠杆菌释放后的大肠杆菌拷贝选择普遍性原因。选择普遍性试验车一型式五份完成，并在 Prism7(Graph Pad) 之中应用于单向绝对值 (One-Way ANOVA) 二阶及 Dunnett 后化验 (Dunnett's Post Test)，意在确认统计数据显着普遍性。显著普遍性值用星号表示如下：*p
为了有利于验证应用于实为大肠杆菌提供的结果，我们检验了 RDS 对于 SARS-CoV-2 感染者的截断传染普遍性意志力。如绘成 3D 下图，RDS 同时也截断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 酶的感染者。RDS 在乙醇 1:40 以上时可显著减少大肠杆菌淡褐色的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 实为大肠杆菌与传染普遍性大肠杆菌的除此以外，RDS 包包涵选择普遍性 SARS-CoV-2 感染者的能活普遍性果糖，或许是通过从外部灭能活大肠杆菌或截断大肠杆菌的20世纪感染者时程。
为有利于研究岗位或许的机制，我们将传染普遍性 SARS-CoV-2 大肠杆菌薄膜与不间断乙醇的 RDS 在 37°C 下预培育出 1 星期。随后，将复合物有利于分别为乙醇-(10–1 至 10–4)，并申请特入 Vero 酶完成怪菌斑二阶以确认大肠杆菌感染者普遍性的降低。如绘成 4A 下图，我们推论到在 RDS 之中短时间受伤害一星期后的大肠杆菌薄膜，其 SARS-CoV-2 的感染者效价也圆形抗生素缺少普遍性下降。该结果属下实了 RDS 可有效率从外部灭能活 SARS-CoV-2 大肠杆菌薄膜的传染普遍性。
我们有利于检验了 RDS 是否也能选择普遍性 SARS-CoV-2 大肠杆菌种属下的感染者。为此，我们来进行除此以外开发计划的复合七轮大肠杆菌-SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来合成一三部 S 酶举例来说，仅限于大英帝国举例来说 (B.1.1.7)，南非举例来说 (B.1.351)，哥斯达黎特举例来说 (P.1)，特州举例来说 (B.1.429)，和其他几个新兴举例来说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和关的 S 酶药剂内体在 37°C 不间断乙醇 RDS 培育出 1 星期。随后，用该复合物感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶。感染者后 12 星期，荧光伦酶测大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用。如绘成 4B 下图，我们还推论到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶举例来说的抗生素缺少普遍性选择普遍性。
我们还检验了 RDS 截断 SARS-CoV 感染者的意志力，应用于带有 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 刊文基因太快大肠杆菌和[15] 实为抗生素。我们将人 A549(ACE2) 酶用途靶酶，将其用三部乙醇的 RDS 模板，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因实为大肠杆菌感染者 4-6 星期。感染者后在不包涵 RDS 的原因培育出酶，流型式酶绝技二阶测其对大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用。同样，应用于高氯硫丙啶剔除刚刚死亡者与已死亡者的酶，大部分在能活酶群之中二阶 GFP+酶。如绘成 5A 下图，我们推论到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 实为型大肠杆菌的选择普遍性关键作用圆形抗生素缺少普遍性。我们有利于属下实了这些结果，并二阶了 RDS 介导的选择普遍性与 Luc 刊文基因 SARS-CoV 实为型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们推论到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的选择普遍性关键作用圆形抗生素普遍性缺少，其半选择普遍性分子量 (IC50) 为 1:70.88 乙醇度 (绘成 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应用于 ACE2 感染者靶酶，我们还检验了 RDS 的炎大肠杆菌能活普遍性是否大部分针对与 ACE2 有电磁力的冠状大肠杆菌。为此，我们测了一种不关的的负链 RNA 大肠杆菌--肝炎病毒霍乱大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝伦 (HA) 和酶α-唾液硫来感染者靶酶。为了合成肝炎病毒霍乱大肠杆菌，将传达肝炎病毒霍乱 A/WSN/33(H1N1) DNA每个相片的 8 个多种形式和一个 GFP-刊文基因共计转染到 HEK293T 酶之中。在 RDS 实为定的原因，收集大肠杆菌薄膜还用于感染者要能 MDCK 酶。如绘成 6A 下图，我们推论到 RDS 对肝炎病毒霍乱大肠杆菌的选择普遍性关键作用圆形抗生素缺少普遍性。RDS 在 1:40 和 1:80 乙醇时可完全截断大肠杆菌感染者，在 1:160 乙醇时则可部分选择普遍性肝炎病毒霍乱。RDS 对 MDCK 酶的半伤人分子量 (LC50) 经测为 1:18.5(绘成 6B)。这些除此以外，RDS 的炎大肠杆菌能活普遍性并非针对特定大肠杆菌，而或许必须普遍选择普遍性多种细菌感染大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和肝炎病毒霍乱大肠杆菌。
▋讨论
在本报告之中，我们验证了习惯本品厌肺毒抗生素液 (RDS) 包包涵广谱炎大肠杆菌能活普遍性，可截断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和肝炎病毒霍乱大肠杆菌的感染者。虽然 RDS 必须选择普遍性多种大肠杆菌，但其炎大肠杆菌能活普遍性因大肠杆菌类别和HIV而异。例如，对 SARS-CoV 太快实为大肠杆菌的 I-C50 分子量为 1:7.9 乙醇度，对 SARS-CoV-2 太快实为大肠杆菌的 I-C50 分子量为 1:230 乙醇度。对于传染普遍性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 乙醇度，对肝炎病毒霍乱，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其种属下有多种不同的选择普遍性关键作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 乙醇度不等 (绘成 4B)。
(方知下一页绘成)
绘成 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和则有的 Ha-CoV-2 种属下不具抗生素缺少普遍性灭能活关键作用。ASARS-CoV-2 薄膜特不间断乙醇的 RDS 在 37°C 下培育出 1 星期。随后，将复合物有利于不间断乙醇，并申请特入 Vero 酶之中完成怪菌斑二阶，以确认大肠杆菌感染者普遍性降低。选择普遍性试验车一型式五份完成，并在 Prism7(GraphPad) 之中应用于单向绝对值 (One-WayANOVA) 二阶和 Dunnett 后化验 (Dunnett'sPostTest) 意在确认统计数据显着普遍性。显著普遍性值用星号表示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和关的 S 酶举例来说与不间断乙醇的 RDS 在 37°C 培育出 1 星期后，用复合物感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶。感染者后 12 星期，荧光伦酶测大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用。RDS 的 IC50 值的乙醇度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们有利于验证了 RDS 可以选择普遍性冠状大肠杆菌的20世纪感染者时程。虽然完全一致的炎大肠杆菌机制都已清楚，但 RDS 可以通过从外部灭能活大肠杆菌薄膜或通过阻拦大肠杆菌侵入或截断大肠杆菌侵入后的20世纪时程来阻拦大肠杆菌感染者。在其他几种习惯之药用植物之中也方知到了炎 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的能活普遍性。例如，一种常方知的习惯之药用植物——姜黄。
姜黄根之中已验证包包涵姜黄硫伦，可选择普遍性 SARS 大肠杆菌[32] 诊断分离株的拷贝。此外，另一种可用于用药细菌感染结核病的之药用植物——双黄连抗生素，已结果显示成在排泄以抗生素缺少普遍性方型式选择普遍性 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 能活普遍性。龙胆有机体碱和龙胆伦拟作为双黄连截断 3CLpro[33] 的有效率果糖。
绘成 5 RDS 选择普遍性 SARS-CoV 实为型大肠杆菌对 A549(ACE2) 酶的感染者。用不间断乙醇的 RDS 模板 A、B 酶，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 实为型大肠杆菌感染者。将酶清沾，省略大肠杆菌和 RDS，在不实为定 RDS 的原因完成培育出。在感染者后 48 星期和 72 星期，通过流型式酶绝技或荧光伦酶测来定量大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用。测试多次重复三次。素描抗生素响应直线，并素描 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 乙醇度 (C)
绘成 6 RDS 选择普遍性七轮流大肠杆菌对 MDCK 酶的感染者。(A) 用不间断乙醇的 RDS 模板 MDCK 酶 30 分钟，然后用七轮流大肠杆菌 (GFP) 对其完成感染者。感染者后，在 RDS 实为定下培育出酶。36 星期后用流型式酶郭子对大肠杆菌感染者的选择普遍性关键作用完成定量。把未感染者的酶与被七轮流大肠杆菌 (GFP) 感染者但予以 RDS 处理的酶完成对比。绘成之中结果显示了 GFP+酶的百分比。PI 表示高氯硫丙啶 PI。
(B) 另外还应用于了 MTT 分型定量了 RDS 对 MDCK 酶的毒普遍性，素描了酶毒普遍性的抗生素-化学反应直线，经测算，RDS 的半数伤人分子量为 1:18.5 乙醇度 RDS 的有效率炎大肠杆菌果糖都已确认。然而，RDS 多种不同于龙胆有机体碱和龙胆伦，RDS 可以通过从外部灭能活大肠杆菌中微子来截断大肠杆菌感染者 (绘成 4)，而龙胆有机体碱和龙胆伦则在大肠杆菌生命周期的初通过截断大肠杆菌酶酶的能活普遍性来发挥关键作用。然而，RDS 的排泄炎 SARS-CoV-2 能活普遍性仍需在今后的爬虫类研究岗位和本能诊断试验车之中赢取属下实。迄今为止，我们刚刚完成小型爬虫类测试，以确认 RDS 在细胞内截断 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染者的发展前景。
▋论证
我们的研究岗位表明，RDS 可普遍选择普遍性细菌感染大肠杆菌的感染者，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和肝炎病毒霍乱。
▋方法有
酶和酶培育出
HEK293T (ATCC 卡萨奇克，特拉华州) MDCK (ATCC 卡萨奇克，特拉华州)，VeroE6 (ATCC 卡萨奇克，特拉华州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨奇克，特拉华州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨奇克，特拉华州) 迄今为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific) 包包涵 10% 微灭能活 FBS 和 1×头孢菌伦-链霉伦 (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶培育出基之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的分子量申请特入嘌呤霉伦和潮霉伦 B。
真核生物转染和大肠杆菌合成
包涵 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的太快普遍性实为型大肠杆菌薄膜由 Virongy LLC (Manassas，VA) 仅限于，或按照末尾说明了的方法有[15] 合成。简言之，为了合成 GFP 刊文基因太快普遍性实为大肠杆菌，HEK293T 酶与传达 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的多种形式、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共计转染。为了产成荧光伦酶刊文基因太快普遍性实为型大肠杆菌，将 HEK293T 酶与传达 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的多种形式、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 完成共计转染。转染后 48 星期收集大肠杆菌上清液，离心一定量，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 仅限于。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因真核生物和 A/WSN/1933 H1N1 则有真核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 麻省理工学院友好仅限于。在霍乱大肠杆菌 A-GFP 刊文基因中微子合成之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共计转染 HEK293T 酶 (ΔAT6)。48 星期后收集大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 传达多种形式自行设计 Sinobiological。来进行 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多种形式和 S 酶药剂内多种形式。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶药剂内中微子按照末尾说明了方法有[31] 完成合成。
大肠杆菌感染者和本品选择普遍性试验车
RDS(厌肺毒抗生素液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，特拉华州) 是由马麻省理工学院测试室 (Burnaby，BC，Canada) 产成的一种商业产品。RDS 之中所有之中精油果糖均适用范围《之东亚药典 2015 年版》「饮片」新标准，仅限于有效率果糖包涵量及重金属下、农药预购测。RDS 是一种之药用植物的共计煎剂，事与愿违中间体在真空有条件下融化。SARS-CoV-2 炎血清由 LanceA. Liotta 医生仅限于。将阿比朵尔盐硫盐 (Sigma) 新的凝胶在二羧硫亚砜 (Sigma) 之中。对于实为型大肠杆菌感染者，12 孔板之中的 A549(ACE2) 酶 (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨奇克，特拉华州) 或 VeroE6 酶用 RDS 模板 30 分钟，在 37℃ 下感染者 4-6 星期，然后在水果培育出基之中温水培育出 48-72 星期。对于 VeroE6 酶的感染者，酶也被 CoV-2 实为型大肠杆菌感染者弱化剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨奇克，特拉华州) 模板后，在 37°C 下再行处理 30 分钟。应用于 GloMaxDiscover 酶标郭子 (Promega) 二阶酶裂解物的荧光伦酶能活普遍性。对于野生型 SARS-CoV-2 感染者，VeroE6 酶在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 感染者 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在詹姆士米切尔该大学的 BSL-3 收容设备内停留 1 星期。酶用 PBS 温水 2 次，用包涵 RDS 的培育出基培育出 48 星期。从上清之中浓缩大肠杆菌，用 12 孔板培育出的 Vero 酶单层之中的怪菌斑试验车测小瓶滴度。简言之，每个样本在明晰的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育出基 (VWR) 之中合成，包包涵 1X 头孢菌伦-链霉伦 (VWR)，并移除 10% 的 FBS(赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种乙醇液用者附到 VeroE6 酶单层的三个直线孔上 1 星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分明晰的 Eagle Minimal Essential 培育出基 (VWR) 的复合物布满单层，包涵 1X 头孢菌伦-链霉伦，并移除 10%FBS。48 星期后，将单层膜一般而言在 10% 七轮醛水溶液之中 1 星期，并去除布满的琼脂塞。为了染淡褐色，申请特入包包涵 20% 乙醇的 1% 结晶紫染剂水溶液 5 分钟，然后用去离子水温水。对于肝炎病毒霍乱大肠杆菌感染者 MDCK 酶，在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 A-GFP 刊文基因大肠杆菌感染者 6 星期。用包涵 RDS 的培育出基温水酶，培育出 36 星期。GFP 传达通过流型式酶郭子定量。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌薄膜的 RDS 灭能活试验车，将 100μl 不间断乙醇的 RDS 移除到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，事与愿违 RDS 乙醇为 1:20，1:40 或 1:80。也仅限于对应有条件 (1 ml 大肠杆菌+100μl 培育出基)。复合物在 37°C 下培育出 1 星期。随后，对复合物完成三部乙醇以诱发额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 乙醇度，并将不间断乙醇的样本申请特入 12 孔板之中的 Vero 酶之中，用于完成怪菌斑测二阶。淡褐色测之中事与愿违的 RDS 乙醇度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 乙醇液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶药剂内中微子按照末尾说明了的方法有[31] 合成。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭能活，将 5μl 不间断乙醇的 RDS 移除到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或举例来说之中，事与愿违 RDS 乙醇度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将复合物在 37°C 下培育出 1 星期，然后在 RDS 实为定下感染者 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶 12 星期。应用于 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 二阶酶裂解物的荧光伦酶能活普遍性。
酶毒普遍性二阶测
用高氯硫丙啶染和流型式酶绝技二阶对 A549 (ACE2) 酶和 VeroE6 酶的本品酶毒普遍性完成测，如概述 (34)。应用于酶增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的方案对 MDCK 酶的本品毒普遍性完成二阶。简言之，将 MDCK 酶 (ATCC) 以每孔 1×-105 个酶的速度接种到 12 孔板之中。酶培育出隔夜后，通过 RDS 处理 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的培育出基之中培育出。将酶与标记试剂共计同培育出 4 星期，再行更进一步申请特入 MTT 增水溶液。培育出皿圈养过夜，用 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 测用者表面温度。
简写
SARS-CoV：严重急普遍性颤动系统性疾病关的冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 严重急普遍性颤动系统性疾病关的冠状大肠杆菌-2；TCM：习惯之药用植物；RDS：细菌感染排毒抗生素液；Ha-CoV-2：复合肝炎病毒新冠大肠杆菌实为大肠杆菌。
致谢
感谢 FengLi 仅限于霍乱大肠杆菌传达多种形式，感谢 LanceLiotta 仅限于炎毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与建议；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 仅限于 RDS 和精油精油。
所写贡献
此次测试由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 外观设计，由 Y.W. 撰述，由 L.A.H. 校对。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该测试。所有所写已阅读并核准事与愿违稿件。
资金来源
本研究岗位的资金来自于詹姆士米切尔该大学结构上捐款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该税款由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 仅限于。
数据和材料的可用普遍性
本研究岗位之中诱发或二阶的所有数据均包包涵在本文之中。试剂可从 Y.W 处提供。
声明
核准及参与决定
不适用范围
决定成版
不适用范围
竞争性公共计利益
詹姆士米切尔该大学国内有机体威慑和病原之其中心的 RMH 和 YW 已提供了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究岗位资助，LAH 为德佳和畅转任负责人并提供了酬金。没有其他关系或社区能活动或许都会影响到提交的岗位。
所写详细信息
1英国特拉华州詹姆士米切尔该大学系统有机体学所学院国内有机体威慑和病原之其中心，卡萨奇克 20110。
2VirongyLLC，特拉华州卡萨奇克。3纽西兰伯纳比，BCV5J0E5 马麻省理工学院测试室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 英国特拉华州利斯堡WHO社都会科学民间组织，20176。
收稿年份：2021 年 4 年底 7 日
遵从年份：2021 年 5 年底 10 日
线上成版时间：2021 年 5 年底 29 日
概述
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校对： 翟微男相关新闻
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